Este tutorial le mostrará cómo hacer un termociclador desde cero por aproximadamente $ 85. En resumen, la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) amplifica bits de ADN, creando millones de copias de una secuencia objetivo. Puede usarlo para analizar una muestra de ADN de un gen específico, por ejemplo, para verificar la modificación genética en los alimentos y las pruebas genéticas hereditarias.

Durante la PCR, una mezcla de ADN, cebador y ADN polimerasa se cicla entre tres configuraciones de temperatura diferentes, una y otra vez. Este proyecto utiliza un arduino para controlar dos resistencias de alta potencia para calentar la muestra, un ventilador de computadora para enfriarse y un termopar para mantener un registro de la temperatura. El diseño admite dos muestras a la vez, aunque probablemente podría extenderse para admitir más.

Todas las piezas están listas para usar, y el ensamblaje debe tomar algunas horas. Necesitará acceso a una tienda (por lo menos una sierra y una taladradora).

Este proyecto sigue siendo un trabajo en progreso de Stacey Kuznetsov ([email protected]) y Matt Mancuso ([email protected]). Por favor, envíenos un correo electrónico si tiene alguna pregunta o comentario! También, muchas gracias a Rich Pell, James Lata y ATX Hackerspace por los materiales y comentarios.

Suministros:

Paso 1: Más sobre la PCR

Para ejecutar la PCR, necesita ADN, cebadores que coincidan con la secuencia que está intentando replicar y polimerasa.

La PCR consta de 3 pasos que se repiten una y otra vez:

Desnaturalización (~ 94C) En este paso, el ADN se "separa" y se divide de una doble hélice en cadenas simples.

Los cebadores de recocido (~ 60C) se unen al ADN monocatenario

La polimerasa de extensión (~ 72C) complementa el ADN, sintetizando las hebras que son de la secuencia objetivo

Cada una de estas fases puede durar entre 20 y 30 segundos y repetirse más de 30 veces, según el protocolo. La mayoría de los protocolos también sugieren tener un paso de desnaturalización inicial más largo y un paso de extensión final más largo.

Un tutorial simple:

www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

También hay un montón de recursos relacionados aquí:

Los resultados de la PCR se pueden visualizar mediante electroforesis en gel. Las muestras de ADN se cargan en un gel, y se aplica un alto voltaje a través de él. Debido a que el ADN está cargado negativamente, viajará a través del gel a diferentes velocidades dependiendo de su tamaño. Este proceso separará efectivamente las piezas que desea, y puede verlas tiñendo el gel. Aquí hay un buen tutorial y si estás intentando hacerlo tú mismo, el Proyecto Macgyver es un recurso bastante bueno.

La PCR se puede realizar utilizando 3 baños de agua (cada uno mantenido en uno de los tres ajustes de temperatura). Un humano podría mover físicamente las muestras de un baño a las siguientes 30 o más veces. Las máquinas de PCR se desarrollaron para automatizar el proceso, pero la mayoría de las que tienen calidad de laboratorio cuestan miles de dólares. ¡Pero no necesitan hacerlo! Hoy en día hay un número creciente de proyectos de PCR de código abierto, entre ellos OpenPCR (600 $), LavaAmp ($ 200) y el Coffee Cup PCR (350 $).

Paso 2: Materiales

Esto es lo que necesitas:

2 resistores Wiremound, 150 ohmios / 50 vatios cada uno (10 $ en total)

Epoxi térmico de plata ártica ($ 14)

Relé de estado sólido, como 25A AC / DC SSR ($ 8.50)

Bloque de aluminio, dimensiones finales ~ 64 mm x 64 mm x 26 mm. cheque ebay (gratis - $ 5)

Tablero Arduino, utilizamos el mini ($ 20).

MAX31855 ruptura (utilicé este por $ 11, pero el Adafruit uno podría ser más confiable por $ 17.50)

Cable de termopar ($ 10)

Ventilador de 60mm ($ 4)

Transistor de 12V (TIP120 debe estar bien, $ 0.70)

Fuente de alimentación 12DC, 0.5A ($ 1)

Cable de corriente regular

Plywood (si quieres hacer un caso)

Unos pernos y tuercas de diferente longitud (si está haciendo el caso) usamos pernos de 6x1 "y 2x2" # 6 con tuercas iguales

También estarás usando:

Algunos cables

Breadboard (pequeño)

Cortadores de alambre / pelacables

Cinta electrica

Soldador / soldadura

Destornillador

Sierra de sierra y taladradora

Cortador láser (si quieres hacer un caso)

Pegamento para madera (si quieres hacer un caso)

Paso 3: El bloque de aluminio

Elegimos el aluminio para alojar nuestras muestras porque es un conductor térmico realmente bueno y también es relativamente fácil de adquirir y trabajar. Mecanizamos el centro del bloque para que las resistencias puedan encajar para "emparedar" las muestras. El exterior del bloque se corta como un disipador de calor para permitir un enfriamiento más rápido.

Las imágenes de abajo tienen nuestras dimensiones aproximadas (en mm). Matt fue muy preciso al cortarlo, pero no creo que tenga que ser muy exacto.

Paso 4: El resumen del circuito

El circuito consta de 1) un relé de estado sólido que acciona las resistencias del calentador; 2) un ventilador, alimentado por la fuente de 12 CC y controlado por el arduino a través de un transistor NPN; y 3) un termopar con una ruptura MAX31855

Al conectar la electrónica por primera vez, sugiero el uso del tablero, no la soldadura. ¡Si terminas haciendo un caso, tendrás que desconectar y volver a conectar algunas cosas para que encajen!

Paso 5: El circuito de resistencias

Divida y desmonte el adaptador de corriente como se muestra en la primera imagen. Conecte los resistores de la siguiente manera:

Cable negro -> pin 1 (pin AC) en el relé

Cable blanco-> una de las resistencias. Conecte la segunda resistencia en serie. Conecte las segundas resistencias al pin 2 (pin de CA) en el relé.

Conecta arduino al relé.

Arduino pin 7 -> pin 3 (+ pin DC) en el relé

Arduino GND -> pin 4 (-DC pin) en el relé

Cubra todas las conexiones con cinta aislante !!!

---- algunas matemáticas ---

Con 2 resistencias de 150 ohmios en serie, la resistencia total debe ser de 300 ohmios. Por lo tanto, si la tensión de salida de los EE. UU. Es de 120 V, la corriente debería ser de 0.4Amps, lo que hace que el vataje sea de 48 vatios. Las resistencias tienen una potencia nominal de 50 vatios, por lo que debería estar bien, pero verifique nuevamente los cálculos, especialmente si su tomacorriente funciona a 230 V (necesitará diferentes resistencias con mayor potencia).

Paso 6: El circuito de ventilador

Esta es una configuración básica en la que el ventilador está alimentado por la fuente de alimentación de CC, que está controlada por el arduino a través de una resistencia NPN. ITP tiene un gran tutorial sobre eso. Aquí está la configuración del proyecto

Arduino pin 9 -> base de transistor

Cable negro del ventilador -> colector transistor

Arduino GND-> emisor de transistores

Arduino GND -> masa en el adaptador de CC (cable negro)

Cable rojo del ventilador -> cable rojo (alimentación) en el adaptador de CC

Paso 7: El circuito, termopar y MAX31855 Breakout

Hay un impresionante tutorial sobre cómo configurar el termopar y la ruptura. Nuestro proyecto prácticamente lo siguió exactamente, por lo que las conexiones son:

Arduino pin 4 -> DO pin en la ruptura MAX31855

Arduino pin 5 -> CS pin en la ruptura MAX31855

Arduino pin 6 -> CLK pin en la ruptura MAX31855

Arduino GND & VCC -> a GND y VCC en la ruptura MAX31855

Los tornillos del termopar en la placa de ruptura (cable amarillo al +).

Paso 8: Asamblea

Use el adhesivo térmico para unir las resistencias a las muescas en el bloque de aluminio. El adhesivo tarda aproximadamente 5 minutos en colocarse, asegúrese de que las superficies estén al ras (esto determinará qué tan rápido puede transferir calor a la muestra).

También puede usar el adhesivo térmico para pegar el extremo del cable del termopar al bloque (ahí es donde se detecta la temperatura). Obtendrá una mejor precisión si incrusta el cable en el bloque. Puede perforar un pequeño orificio en la parte superior, entre los orificios del tubo de PCR y conectar el termopar a eso.

Paso 9: Prueba con código

Puedes echar un vistazo al código del proyecto aquí. Probablemente también necesitará la biblioteca max6675. La idea básica es que pulsas la corriente a través de las resistencias para calentarse (configurando el pin 7 de Arduino en alto); y encienda el ventilador para que se enfríe (ajustando el pin 9 de Arduino a alto). Puedes verificar la temperatura encuestando el termopar.

Lo principal es no sobrecalentar (o incluso explotar) las resistencias y la muestra. *** ¡¡No querrás dejar la corriente en funcionamiento a través de las resistencias durante largos períodos de tiempo !!! *** El termopar no responderá instantáneamente a los cambios de temperatura. Nuestro código de 'calentamiento' funciona a través de las resistencias durante aproximadamente medio segundo y luego verifica el termopar. Cada 15 segundos, el sistema se apaga y espera a que se alcance una temperatura constante. Esto asegura que atrapemos los retrasos de los termopares y también dejemos que el bloque de aluminio se caliente de manera uniforme. Nuestro código de calentamiento también tiene algunos controles para asegurarse de que el termopar esté conectado correctamente, que no se caliente demasiado rápido, no se sobrecaliente, etc.

Además, ¡la seguridad es lo primero, *** no quieres dejar esto al correr sin verlo! ***

Cuando se enfríe, recuerde que el ventilador continuará moviéndose durante unos segundos después de que se apague, por lo que es mejor apagar el ventilador 1 o 2 grados antes de alcanzar la temperatura ideal.

La temperatura se mantiene constante pulsando los resistores durante una pequeña fracción de segundo y comprobando constantemente los valores de temperatura. Dadas las limitaciones del termopar y Arduino, puede obtener una precisión de +/- 0.5C. Sin embargo, dado que el sitio web de Adafruit informa una precisión o + -2 ° C, es posible que también deba calibrar su termopar con un termómetro real primero.

Los 32 ciclos completos duran aproximadamente 3 horas (dependiendo de cómo esté configurado el caso).

Paso 10: Caso

Esto es algo opcional, pero la carcasa hace que los tiempos de calentamiento sean mucho más rápidos. Utilizamos BoxMaker para hacer una caja simple, y la modificamos un poco. Añadimos un montón de agujeros para la ventilación en el frente y los lados. También agregamos agujeros para los tornillos de montaje para el ventilador en la parte posterior. La pieza inferior tiene 2 orificios para tornillos para sujetar el relé, y 2 orificios más para tornillos más altos para que se asiente el bloque de aluminio. La parte superior consta de 2 piezas separadas para facilitar el acceso. Puede agarrar el archivo VSD.

Para el material de la caja, la madera o la madera contrachapada deben estar bien porque es un aislante bastante bueno.

Una vez que haya cortado las piezas con láser, coloque el relé en la parte inferior. Usuario tornillos más cortos para el relé. Fije el ventilador a la pieza posterior, asegurándose de que el ventilador se asiente dentro de la caja.

Luego, puede usar pegamento para madera para unir la parte inferior, los lados y la espalda.

El bloque de aluminio se asienta sobre los dos tornillos más altos. Perforamos 2 agujeros adicionales en la parte superior e inferior del bloque de aluminio para que se ajuste mejor (aproximadamente 48 mm de separación).

Es posible que deba volver a ensamblar algunos de los circuitos para hacer que los cables pasen por la caja. El frente y la parte superior van por último.

Paso 11: ¡Corre!

Puede probarlo usando aceite mineral, o puede gastar $$ y obtener un kit de PCR real como este. Puede acelerar los tiempos de enfriamiento poniendo algo de hielo detrás del ventilador. Actualmente, 32 ciclos tardan unas 3 horas.

Segundo premio en el

Concurso Green Tech